pSicoR-Ef1a-mCh-Puro

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pSicoR（Cre 可控、慢病毒、shRNA 双荧光载体）

慢病毒介导、Cre‑Lox 可控、带 EGFP 荧光标记的 shRNA 干扰载体，常用于稳定细胞系与体内条件性敲低（Addgene #11579，Tyler Jacks 实验室，2004）。

一、基本参数

• 载体骨架：慢病毒（HIV‑1 衍生）

• 全长：7,567 bp

• 原核抗性：Ampicillin（氨苄青霉素）

• 真核标记：EGFP（绿色荧光），独立表达

• shRNA 启动子：mU6（Pol Ⅲ），组成型表达

• 诱导系统：Cre‑LoxP（双 LoxP 夹 EGFP+shRNA）

• 克隆位点：HpaI（5′）、XhoI（3′）

• 宿主 / 适用：哺乳细胞、稳转株、动物体内（小鼠）

• 扩增菌株：Stbl3（推荐，降低重组）、NEB Stable

二、核心结构（双荧光 / 可控原理）

1. 慢病毒骨架：LTR、ψ 包装信号、RRE、cPPT，保证高效感染与整合。

2. shRNA 表达盒：

• mU6 → HpaI‑XhoI（插入 shRNA 寡核苷酸）→ 终止子

3. EGFP 表达盒：CMV‑EGFP，独立转录，绿色荧光标记阳性细胞。

4. Cre‑LoxP 控制区（关键）：

• 5′‑LoxP → EGFP → mU6‑shRNA → LoxP‑3′

• 无 Cre：EGFP+shRNA 正常表达（GFP+、基因敲低）

• 有 Cre：Cre 重组酶切除两 LoxP 之间片段 → GFP‑、shRNA 沉默（停止敲低）

“双荧光”：野生型 pSicoR 只有EGFP；市场常见pSicoR‑EF1a‑mCherry（红荧光），可做GFP/mCherry 双荧光对照，用于分选与示踪。

原版 pSicoR（Addgene #11579）

“双荧光 pSicoR” 是后人改造的版本（不是原始 pSicoR）：

• 最常见：pSicoR‑EF1a‑mCherry（Addgene #31847）

• 骨架：保留原来 LoxP‑EGFP‑LoxP

• 另外多加了一个 EF1a → mCherry（红荧光），这个不在 LoxP 之间，切不掉

• 所以变成：

• mCherry（红）：一直亮，代表细胞成功感染了病毒

• EGFP（绿）：有 Cre 就灭，代表 shRNA 是否在工作

三、shRNA 可被 Cre “关闭”

1. 可控 + 可逆：shRNA 可被 Cre “关闭”，适合时间 / 空间条件性敲低（如组织特异性 Cre 小鼠）。

2. 双荧光 / 易分选：EGFP 直接标记阳性细胞，FACS 分选 / 荧光显微镜可视化，转染 / 感染效率高。

3. 慢病毒 + 稳转：整合入基因组，长期稳定敲低，优于瞬时 siRNA。

4. 通用性强：细胞系、原代细胞、体内实验（小鼠）均适用，发表文献多。

5. 克隆简单：HpaI+XhoI双酶切，直接退火连接 shRNA 寡核苷酸。

四、克隆与使用要点（实操）

1. shRNA 设计：21–23 nt，发夹结构，两端加HpaI/XhoI粘性末端。

2. 酶切：pSicoR 用HpaI+XhoI双酶切，胶回收骨架。

3. 连接：退火 shRNA 双链与骨架连接，转化Stbl3。

4. 包装慢病毒：与 **pMD2.G（包膜）、psPAX2（包装）** 共转 293T，收上清感染目标细胞。

5. 筛选：EGFP 阳性即为整合成功（无需抗生素）。

6. Cre 诱导：转 Cre 质粒或用 Cre 病毒 → GFP 消失、敲低终止。

五、常见变体（双荧光 / 红荧光）

• pSicoR（EGFP，#11579）：经典绿荧光。

• pSicoR‑EF1a‑mCherry（#31847）：红荧光，双荧光对照首选。

• pSicoR‑Pur：加嘌呤霉素抗性，可药筛。

六、与 pLKO.1 对比（选型参考）

• pSicoR：EGFP 标记、Cre 可控、可逆、慢病毒；适合条件性敲低 + 可视化。

• pLKO.1：Puro 抗性、不可控、单向敲低；适合稳定敲低 + 药筛。