mScarlet3 荧光报告基因

pCMV-mScarlet3-MCS-Neo 质粒介绍

这是一款哺乳动物细胞常规表达载体，主打红色荧光标记 + 外源基因插入 + 真核细胞药物筛选，广泛用于细胞过表达、示踪、蛋白定位、稳转细胞株构建。

一、质粒介绍

1. p：plasmid，代表质粒载体

2. CMV：巨细胞病毒早期启动子

   强组成型启动子，在绝大多数哺乳动物细胞中持续、高效驱动下游基因转录，适用细胞谱广。

3. mScarlet3：第三代单体红色荧光蛋白

   目前主流亮红色荧光标记蛋白，优势：亮度高、光稳定性强、单体结构（不易聚合，不影响融合蛋白功能）、激发 / 发射峰合适（激发～568 nm，发射～594 nm），适合荧光显微镜、流式细胞仪检测。

4. MCS：多克隆位点（Multiple Cloning Site）

   串联多种限制性内切酶酶切位点，是插入目的基因的核心区域，方便外源基因定向 / 非定向克隆。

5. Neo：新霉素抗性基因（Neomycin resistance）

   真核筛选标记，表达氨基糖苷磷酸转移酶，使转染成功的哺乳动物细胞耐受 G418（遗传霉素），用于筛选稳定转染细胞株。

二、完整功能元件分区 & 作用

按转录 / 复制 / 筛选功能分类，全质粒分为原核元件（大肠杆菌扩增）、真核表达元件（哺乳动物细胞工作）两大模块：

1. 原核扩增元件（用于质粒抽提、克隆）

• Amp^r（氨苄青霉素抗性基因）：大肠杆菌筛选标记。转化后的细菌在含氨苄青霉素培养基中存活，仅含该质粒的菌才能生长。

• ColE1 ori：大肠杆菌复制原点。保证质粒在细菌内自主复制，获得高拷贝质粒。

• f1 ori：噬菌体复制原点，可选用于单链质粒制备、定点突变等分子实验。

2. 真核表达核心元件（哺乳动物细胞功能）

1. CMV promoter + enhancer

   强通用启动子，无细胞特异性，几乎所有人 / 啮齿类哺乳动物细胞都能高效启动转录。

2. mScarlet3 荧光报告基因

   两种使用模式：

• 独立表达：单独发出红色荧光，用于转染效率示踪、细胞标记；

• 融合表达：目的基因插入 MCS，与 mScarlet3 形成融合蛋白，观察蛋白亚细胞定位、蛋白示踪。

3. MCS 多克隆位点

   载体的基因插入窗口，排布多个独特酶切位点，可根据目的基因两端酶切位点选择酶切、连接，实现外源基因克隆。

4. WPRE（木貂肝炎病毒转录后调控元件）

   增强 mRNA 稳定性、提升翻译效率，显著提高目的蛋白 / 荧光蛋白表达量。

5. Poly (A) 终止信号（HSV TK / SV40 polyA）

   终止 mRNA 转录，保证转录本完整，提升表达效率。

3. 真核筛选元件

• Neo 抗性基因 + SV40 启动子

  由 SV40 弱启动子驱动 Neo 表达，转染细胞后加G418药物培养：未转染细胞死亡，阳性转染细胞存活，最终筛选出稳定细胞系。

三、载体主要用途

1. 瞬时转染实验

   快速检测转染效率（观察 mScarlet3 红色荧光）、外源基因瞬时过表达、蛋白亚细胞定位。

2. 稳定细胞株构建

   利用 Neo/G418 筛选，获得持续表达目的基因 + 荧光的稳转细胞系，用于长期功能实验。

3. 融合蛋白表达

   目的基因插入 MCS，与 mScarlet3 融合，实现活细胞动态示踪、共定位分析。

4. 常规基因功能研究

   适用于肿瘤细胞、正常细胞、干细胞等多数哺乳动物细胞的基因过表达研究。

四、关键特点与优缺点

优点

1. 启动子强，表达水平高；

2. mScarlet3 荧光性能优异，成像、流式检测效果好；

3. 双筛选系统：细菌用氨苄、细胞用 G418，克隆 + 稳转流程成熟；

4. 含 WPRE 元件，进一步提升表达；

5. MCS 位点丰富，克隆兼容性强。

局限

1. CMV 为广谱启动子，无组织 / 细胞特异性，不适合组织特异性表达实验；

2. 仅单一红色荧光，如需多色共定位，需搭配其他荧光载体。

五、典型使用流程简述

1. 分子克隆：将目的基因酶切连接至载体 MCS，构建重组质粒；

2. 大肠杆菌扩增：转化感受态菌，氨苄抗性筛选，大量抽提质粒；

3. 细胞转染：将重组质粒转染目标哺乳动物细胞；

4. 检测 / 筛选：

• 瞬时实验：24–72 h 直接观察红色荧光、检测基因 / 蛋白表达；

• 稳转株：加入 G418 加压筛选，挑取单克隆，扩增鉴定。

全序列：GTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGCTAGCGCCACCATGGATAGCACCGAGGCAGTGATCAAGGAGTTCATGCGGTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCATGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAGGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCTCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAGGGCCTTCACGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTGGAAGCAGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGCCGTGTCCGTGGCCCAGGACACCTCCCTGGAGGACGGCACCCTGATCTACAAGGTGAAGCTCCGCGGCACCAACTTCCCTCCTGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACAATGGGCTGGGAAGCATCCACCGAGCGGTTGTACCCCGAGGACGTCGTGCTGAAGGGCGACATTAAGATGGCCCTGCGCCTGAAGGACGGCGGCCGCTACCTGGCGGACTTCAAGACCACCTACAGGGCCAAGAAGCCCGTGCAGATGCCCGGCGCCTTCAACATCGACCGCAAGTTGGACATCACATCCCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAACAGTACGAACGCTCCGTGGCCCGCCACTCCACCGGCGGCTCCGGTGGCTCCTTGTACAAGTGGATCGGAGGAGGGGGAAGCGGTGGAGGCGGTAGTGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCCTTAAGGGTTCGATCCCTACCGGTTAGTAATGAGTTTGATATCTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAAACGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCAGATCTGCGCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTG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