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做 miRNA 靶基因研究，选择哪个载体合适？
pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector（E1330）是为 miRNA 靶标研究而设计的载体，可通过将 miRNA 的靶序列插入到主报告基因萤火虫萤光素酶基因（luc2）的下游或者 3’端而实现。萤火虫萤光素酶表达的下降意味着内源性的或外源引入的 miRNA 与克隆的 miRNA 的靶序列发生了结合。这一载体是基于 Promega 的双报告基因技术，萤火虫萤光素酶基因（luc2）作为主报告基因，用于监控 miRNA 的调节，海肾萤光素酶基因（hRluc-neo）作为内参 报告基因，用于进行归一化处理和稳定转染的筛选标记。
与 psiCHECK™-2 载体相比有以下特点/优点：pmirGLO 载体主报告基因所带的启动子 PGK 为中等强度的启动子；载体上带有 Neo 抗性基因，可作为稳定转染筛选标记；主报告基因为萤火虫萤光素酶基因，更符合大部分人的使用习惯。 psiCHECK™-2 Vector（C8021）最初是为验证 siRNA 靶标设计的。该载体用海肾萤光素酶（hRluc）作为主报告基因；萤火虫萤光素酶（hluc+）则作为内参 报告基因，用于进行归一化处理。目的基因被克隆至海肾萤光素酶翻译终止密码子下游的多克隆位点。由合成的 siRNA 或体内表达的 shRNA 引发的针对目的基因的 RNAi 过程，导致融合 mRNA 的剪切和随后的降解。
也有文章中用 psiCHECK-2 进行 miRNA 研究。但与 pmirGLO 载体相比，有以下两个缺憾：1. 酶切位点少；2. SV40 启动子活性高，用于调节效果明显的 siRNA 可行，而当 miRNA 抑制作用比较弱时，不容易观察到明显的变化。由于 miRNA 的调节作用通常是微量调节，使用中等强度启动子驱动报告基因表达的载体（如 pmirGLO 载体）通常更合适一些。
miRNA 靶基因 3'UTR 验证：首选 pmirGLO；特殊场景用 psiCHECK™-2
核心区分：pmirGLO 原厂专为 miRNA 靶向设计，psiCHECK2 原本是 siRNA/Ri 干扰载体，二者主 / 内参荧光基因完全相反。
pmirGLO图谱
psiCHECK2图谱
一、元件核心区别（最关键）
1. pmirGLO（推荐常规 miRNA 验证）
主报告：萤火虫 Luc2（PGK 中等启动子），3' 端 MCS 插靶基因 3'UTR；miRNA 结合→萤火虫荧光下降Promega Corporation
内参：海肾 hRluc（SV40 驱动）+Neo⁺抗性，用于归一化，可稳筛稳定细胞株
启动子 PGK强度适中，不会因启动子过强掩盖 miRNA 微弱抑制效果，数据更贴合体内生理调控水平
载体全长～7.35kb，氨苄抗性，酶切位点丰富（XhoI/NheI/SacI/XbaI），克隆便捷
计算公式：Firefly/Renilla，比值下降 = 靶向成立（科研通用统计格式）
2. psiCHECK™-2（siRNA 原生载体，小众 miRNA 用）
主报告：海肾 hRluc（SV40 强启动子），终止子下游 MCS 插 3'UTR；miRNA 结合→海肾荧光下降
内参：萤火虫 hluc（HSV-TK），无 Neo 抗性，不能稳定株筛选，仅瞬时转染
SV40 强启动子驱动海肾，本底表达极高，弱抑制型 miRNA 极易看不出差异，数据波动大
全长～6.27kb，氨苄抗性，可用酶切偏少（XhoI/NotI 最常用）
计算公式：Renilla/Firefly，和绝大多数文献统计格式相反
二、选型对照表（直接对照实验需求）
表格
| 实验需求 | 优先 pmirGLO | 优先 psiCHECK‑2 |
|---|---|---|
| 常规 miRNA-3'UTR 靶向验证（毕业论文 / 基础机制） | ✅首选，90% 文献通用 | ❌不推荐 |
| 需要构建稳定细胞株长期验证 | ✅自带 Neo，G418 筛稳转 | ❌无筛选标记，只能瞬转 |
| miRNA 抑制幅度偏弱（<30% 下调） | ✅PGK 弱启动子，抑制差异易检出 | ❌强启动子掩盖微弱下调 |
| 做多拷贝串联靶位点（4×miRNA 结合序列） | ✅MCS 位点多、承载片段友好 | ✅载体偏小，多串联也能用 |
| 同时做 siRNA 干扰 + miRNA 两套实验 | ❌ | ✅原生 siRNA 载体，一质粒两用 |
| 发文需要匹配高分杂志常规统计范式 | ✅Firefly/Renilla 是通用格式 | ❌比值格式非主流 |
三、使用实操建议
✅绝大多数情况选 pmirGLO
靶基因 3'UTR 插入Luc2 终止密码子下游 MCS；
质粒 + miRNA mimic/NC 共转 293T / 目的细胞，24~48h 裂解测双荧光；
野生 UTR 组比值＜突变 UTR 组 = 直接靶向。
⚠️仅 2 种情况用 psiCHECK‑2
课题同时做 siRNA 靶点筛选 + miRNA 验证，不想备两套载体；
实验室长期习惯海肾做主报告、已有成熟 psiCHECK‑2 实验体系。
四、补充小提示
若后续要稳转细胞验证内源 miRNA，只能 pmirGLO（Neo 抗性是硬性刚需）；
市面上老文献大量用 psiCHECK2 做 miRNA 是历史沿用，近 5 年新课题主流全部换成 pmirGLO。
